LAMP法原理のご紹介

 

 遺伝子増幅法としてはPCR(Polymerase Chain Reaction)が有名です。シータス社のキャリー・マリスが発明者として1993年のノーベル化学賞を受賞しています。検出したい遺伝子配列の一部20塩基程度と、遺伝子の相補的配列の一部20塩基程度の二つのオリゴマー(プローブ)を組み合わせて、耐熱性DNA合成酵素でそれら配列の間の遺伝子領域を増幅する方法です。反応は60~70℃程度で行いますが、生じた二本鎖を一本鎖にするために95℃程度の高温で加熱する必要があるため、温度を変化させるサーマルサイクラーという装置が必要です

LAMP法による遺伝子増幅図

一方、LAMP法は、65℃程度の一定温度で遺伝子を増幅させることができ、また原理上、精度の高い方法として知られています。PCRが二つのオリゴマーを用いるのに対して、LAMP法は4つのオリゴマーを用います。オリゴマーを構成する塩基配列は、6つの特定の塩基配列をターゲットとしています。また、用いられているDNA合成酵素(Bst DNA polymerase)は二本鎖を引き剥がしながら新たな鎖を合成する酵素ですので、PCRほどの高温にする必要はありません。4本のうち、2本はPCR用のプローブとほぼ同じ比較的長いオリゴマーですが、その中にターゲットとなる1つの相補的な塩基配列ともう一つの塩基配列を含みます、残りの二つは、それぞれの塩基配列を含みます。そのため、反応によって作られた一本鎖DNAの両端はループを形成します。そのループ端からさらに合成が始まります。それが進むと一定の繰り返し配列を持った長さの異なるDNAが合成されます。その合成の際にDNA伸長の原料となる三リン酸塩基から切り出された二リン酸(ピロリン酸)マグネシウムの白色結晶が析出してきます。その濁りを検出することで、検出対象となる遺伝子があるかどうかが判別できます。詳しくは図をご参照ください。この図では主鎖に着目してあります。ループ構造からの伸長以外に、ループ構造部分にプローブが結合して伸長する場合もありますので、反応物は複雑になります。

 

論文:Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al., Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA, Nucleic Acids Res., 2000, 28, E63.

総説:LAMP(Loop-mediated isolation amplification)法の原理と応用,モダンメディア 60巻7号2014[医学検査のあゆみ-23] 2014